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Tropinonreduktase-ähnliche Enzyme

Die vielfältige Substratakzeptanz Tropinonreduktase-ähnlicher kurzkettiger Dehydrogenasen/Reduktasen

Arabidopsis Pflanzen

Arabidopsis Pflanzen

Arabidopsis Pflanzen

Enzyme mit geringer Substratpräferenz werden als ursprüngliche Proteine betrachtet, die als Grundlage für die Evolution spezifischer Biokatalysatoren in höheren Organismen dienen.

In Gefäßpflanzen sind zahlreiche kurzkettige Dehydrogenasen/ Reduktasen (SDR) am Sekundärstoffwechsel beteiligt. Diese Enzyme weisen meist eine hohe Substrat- und Reaktionsspezifität auf, ein Beispiel hierfür sind die Tropinonreduktasen. In den meisten bekannten Pflanzengenomen und auch in einigen Bakteriengenomen ist eine Gruppe von SDR zu finden, die mit einer DNA-Sequenzidentität von mehr als 50% mit Tropinonreduktasesequenzen aus Solanaceen übereinstimmt. Sie werden deshalb als Tropinonreduktase-ähnliche (TRL) Gene bezeichnet. Die Bezeichnung aber deutet an, dass diese Pflanzen und Bakterien die Fähigkeit zur Tropinon-reduktion besäßen. Das Ziel des Projektes ist die Untersuchung der TRL-Enzyme auf katalytische Charakteristika und Evolvierbarkeit und die Definition ihrer Funktion in Pflanzen.

Ausschnitt Tropanalkaloidbiosynthese

Ausschnitt Tropanalkaloidbiosynthese

Ausschnitt Tropanalkaloidbiosynthese

Dazu werden in einem Teilprojekt zahlreiche TRL-Enzyme aus Brassicaceen rekombinant synthetisiert und deren enzymatische Eigenschaften, wie (Co-) Substratumsatz und Spezifität, gemessen. Die Substratauswahl wird dabei durch die Erstellung virtueller Proteinmodelle, Pharmakophore und Substratpassungsstudien (Docking) geleitet. Es zeigt sich, dass die TRL-Enzyme mehrheitlich nicht in der Lage sind, Tropinon zu reduzieren. Im Gegensatz dazu sind sie fähig, eine große Vielfalt natürlicher und synthetischer Liganden, wie Monoterpene und Steroide, als Substrate zu akzeptieren. Daraus lässt sich eine wichtige Rolle von Genen, die Enzyme mit geringer Substratspezifität codieren, als essentieller Teil des pflanzlichen Genoms ableiten. Möglicherweise bilden diese Gene ein Reservoir für die fortschreitende Evolution metabolischer Diversität.

In einem neuen Teilprojekt soll ausgehend von diesen Ergebnissen im Hinblick auf eine potenzielle biokatalytische Anwendung, untersucht werden, wie sich die isolierten rekombinanten TRL-Enzyme durch gerichtete Mutationen in ihren Eigenschaften (Coenzym- und Substratspezifität, Thermostabilität, Lösungsmittelakzeptanz, etc.) verändern lassen.

Substratvielfalt der TRLs

Substratvielfalt der TRLs

Substratvielfalt der TRLs

Parallel wird in einem dritten Teilprojekt die Funktion der TRL in vivo an TRL-Knock-Out-Pflanzen (Arabidopsis thaliana) erforscht. Mit isolierter RNA aus den Pflanzen kann durch Northern-Blot und quantitativer RT-PCR eine veränderte Genexpression bei Knock-Out und Wildtyp-Pflanzen festgestellt und Rückschlüsse auf die Signaltransduktionswege gezogen werden, die durch das nicht mehr gebildete Protein beeinflusst werden. Weiterhin können durch chromatografische Verfahren mit massenspektrometrischer Analyse Unterschiede im Profil verschiedener Stoffwechselmetaboliten aufgeklärt werden, die Schlussfolgerungen auf betroffene Signalwege zulassen. Neben Arabidopsis thaliana dient in diesem Projekt auch Solanum tuberosum (Solanaceae) als Modellpflanze. Die Kartoffel besitzt unterschiedliche Tropinonreduktasen: die TRII zur Bildung einer Vorstufe in der Calysteginbiosynthese, eine TRI und mehrere TRL, deren Funktion bislang unbekannt ist. Zur Aufklärung der Funktion von TRI und TRL tragen transgene Pflanzen bei, die entweder reduzierte  (RNAi-Silencing) oder erhöhte Mengen des Enzyms produzieren (Gen-Überexpression). Ein verändertes Proteinmuster und veränderte Stoffwechselmetaboliten in diesen Pflanzen können bei der Charakterisierung der biologischen Funktion der Enzyme helfen.

Transgene Kartoffelpflanzen nach Agrobakterien-vermittelter Blattscheibentransformation

Transgene Kartoffelpflanzen nach Agrobakterien-vermittelter Blattscheibentransformation

Transgene Kartoffelpflanzen nach Agrobakterien-vermittelter Blattscheibentransformation

Kooperationspartner:

  • Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie Halle:
    Dr. Sabine Rosahl (AG Induzierte Pathogenabwehr)
    Juliane Fischer und Eva Schulze (AG Computerchemie)

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